Эпигенетическое молчание с помощью комплекса SMC5/6 опосредует ВИЧ

Sep 15, 2023

Природная микробиология, том 7, страницы 2101–2113 (2022 г.) Процитировать эту статью

5997 Доступов

2 цитаты

187 Альтметрика

Подробности о метриках

После проникновения вируса и обратной транскрипции провирусы ВИЧ-1, которые не могут интегрироваться, эпигенетически замалчиваются, но основной механизм остается неясным. Используя полногеномный скрининг нокаута CRISPR/Cas9, мы определили комплекс SMC5/6 хозяина как необходимый для этого эпигенетического молчания. Мы показываем, что SMC5/6 связывается и затем SUMOилирует неинтегрированную хроматинизированную ДНК ВИЧ-1. Ингибирование SUMOylation либо путем точечного мутагенеза компонента SMC5/6 NSMCE2 — лигазы SUMO E3, либо с помощью ингибитора SUMOylation TAK-981 предотвращает эпигенетическое молчание, обеспечивает транскрипцию из неинтегрированной ДНК ВИЧ-1 и спасает репликацию дефицитных по интегразе клеток. ВИЧ-1. Наконец, мы показываем, что блокирование экспрессии комплекса SMC5/6 или ингибирование его активности SUMOylation подавляет возникновение латентной инфекции ВИЧ-1 как в линиях CD4+ Т-клеток, так и в первичных Т-клетках человека. В совокупности наши данные показывают, что комплекс SMC5/6 играет непосредственную роль в установлении латентного периода ВИЧ-1 путем эпигенетического подавления интеграционно-компетентных провирусов ВИЧ-1 перед интеграцией.

Интеграция провирусной ДНК в геном клетки-хозяина является определяющей особенностью жизненного цикла ретровируса, которая необходима для транскрипции и репликации провируса1,2. Ингибиторы интегразы (ИН) мощно ингибируют репликацию ВИЧ-13. В отсутствие функциональной IN неинтегрированные провирусы ВИЧ-1 накапливают репрессивные эпигенетические метки, включая триметилирование лизина 9 на гистоне H3 (H3K9me3), и истощают активирующие метки, такие как ацетилирование H3 (H3Ac)4,5. Хотя эпигенетическое подавление транскрипции неинтегрированной ДНК ВИЧ-1, вероятно, представляет собой защиту хозяина от чужеродной ДНК, основные механизмы и клеточные факторы, которые опосредуют этот эффект, остаются не полностью определенными6,7.

В вирусе мышиного лейкоза (MLV) геномный скрининг выявил компоненты комплекса концентратора сайленсинга человека (HUSH), а также ДНК-связывающий белок NP220, которые имеют решающее значение для сайленсинга неинтегрированной ДНК MLV8. Однако последующие работы9,10 не смогли обнаружить никакой роли комплекса HUSH или NP220 в подавлении неинтегрированного ВИЧ-1. Совсем недавно при скрининге 1217 генов человека, активность которых подавляется белком Vpr ВИЧ-1, был выявлен компонент структурного поддержания комплекса хромосомы (SMC) 5/6, фактор локализации комплекса SMC5/6 2 (SLF2), как критический. для неинтегрированного подавления ДНК ВИЧ-1. Этот скрининг также показал, что шесть других компонентов комплекса SMC5/6, включая SMC5 и 6, а также четыре белка, ассоциированные с SMC5/6, не структурно поддерживают элементы хромосом с 1 по 4 (NSMCE1–4), но не SMC5/6. 6, ассоциированный с фактором SLF1, также имели решающее значение для эпигенетического подавления неинтегрированной ДНК ВИЧ-19. Следует отметить, что ранее было показано, что комплекс SMC5/6 разрушается неструктурным белком HBX вируса гепатита B (HBV), а в отсутствие HBX эписомальная ДНК HBV также подвергается эпигенетическому молчанию11,12. Таким образом, комплекс SMC5/6 не только участвует в хромосомной репликации, рекомбинации и репарации13, но также может подавлять инвазивную вирусную ДНК. Здесь мы стремились определить, опосредует ли комплекс SMC5/6 возникновение латентной инфекции ВИЧ-1.

Чтобы идентифицировать факторы, которые транскрипционно подавляют неинтегрированную ДНК ВИЧ-1, мы провели полногеномный нокаутный скрининг CRISPR/Cas914 в линии CD4+ Т-клеток человека CEM-SS. Мы трансдуцировали субклон CEM-SS, который экспрессирует Cas9 Streptococcus pyogenes, с помощью лентивирусной библиотеки, экспрессирующей ~80 000 одиночных направляющих РНК (sgRNA), нацеленных на 19 114 генов человека15. Семь дней спустя мы инфицированы эти клетки IN-NL-GFPΔEnv10, производным ВИЧ-1, содержащим делецию в env, инактивирующую мутацию D64V16 в IN и открытую рамку считывания зеленого флуоресцентного белка (GFP) вместо nef. Этот вирус сохраняет неповрежденные копии остальных шести генов ВИЧ-1, включая vpr. Через 48 часов после заражения (hpi) клетки GFP+ собирали методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), sgRNA выделяли с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция), а затем клонировали в тот же лентивирусный вектор. После трех раундов отбора клеток GFP+ sgRNA секвенировали и анализировали на предмет обогащения по сравнению с исходной библиотекой sgRNA. Как показано на графике вулкана на рис. 1а, мы идентифицировали 9 генов, которые были обогащены> 16-кратно и имели значение P <0,0005. В их число вошли 3 рецептора клеточной поверхности (LY9, OR52N2 и SSTR2) и 1 моторный белок (MYO1B), которые в дальнейшем не анализировались. Этот анализ также выявил 4 из 8 известных компонентов комплекса SMC5/6, а именно SMC5, SMC6, SLF1 и NSMCE3, а также белок репарации ДНК SWI5 (рис. 1a).